Grupa Nanowarstw Makromolekuł Zakładu Inżynierii Nowych Materiałów

Jednym z głównych kierunków rozwoju nauk biologicznych i medycznych w ostatnich latach jest poszukiwanie nowych metod diagnostycznych i terapeutycznych, pozwalających na wykrycie choroby nowotworowej w jak najwcześniejszym jej stadium, proste rozpoznanie stopnia złośliwości nowotworu i dobór ‘celowanej’ terapii (indywidualnej dla każdego pacjenta). Rozwój choroby nowotworowej jest związany ze zdolnością komórek nowotworowych do nieograniczonego wzrostu, migracji i inwazji obszarów zajmowanych dotąd przez inne komórki. Dlatego niezwykle istotna jest dogłębna analiza oddziaływania komórki z otaczającym ją środowiskiem, mechanizmów poprzez które to oddziaływanie zachodzi oraz wpływu jaki na jej zachowanie wywierają czynniki zewnętrzne. Wiele procesów komórkowych zależy w sposób istotny od oddziaływania komórki z podłożem. Znaczący wpływ na zachowanie komórki może mieć topografia podłoża, jego struktura chemiczna, hydrofobowość a także właściwości mechaniczne. Komórki nie tylko reagują na elastyczność podłoża, lecz mogą także generować siły, które umożliwiają im sprawdzanie jego właściwości mechanicznych. Bodźce fizyczne są przekształcane w sygnały biochemiczne, za pomocą skomplikowanych mechanizmów, takich jak zmiany konformacyjne lub rozwijanie poszczególnych grup białek. Reakcja komórek na zmiany właściwości mechanicznych otoczenia jest obserwowana w wielu procesach biologicznych takich jak starzenie, gojenie ran, choroby układu krążenia czy zmiany nowotworowe. Jednym z najbardziej spektakularnych przykładów obrazujących wpływ właściwości mechanicznych na  los komórek były badania prowadzone przez grupę A. J. Englera, w których pokazano, że proces różnicowania komórek macierzystych może prowadzić do powstania neuronów, mioblastów lub osteoblastów w zależności od elastyczności podłoża, na którym są hodowane. W ramach projektu SONATA (NCN, UMO-2013/09/D/ST5/03859) prowadzone były badania ukierunkowane na porównawczą analizę wpływu właściwości mechanicznych podłoża na adhezję i proliferację linii komórkowych nowotworów o różnym stopniu inwazyjności. Ich celem było stworzenie podłoży o tak dobranych właściwościach, aby możliwe było sterowanie procesami adhezji i proliferacji, prowadzące do kontrolowanego wzmocnienia lub zahamowania wzrostu określonej linii komórkowej. Podłoża takie mogłyby znaleźć szerokie zastosowanie w diagnostyce, do odróżniania komórek o różnym stopniu zaawansowania choroby nowotworowej i do tworzenia biosensorów.

Najważniejsze osiągnięcia projektu:

• elastyczność podłoża ma istotny wpływ na proces adhezji i proliferacji komórek nowotworowych;
• silna tendencja komórek nowotworowych do proliferacji na podłożach miękkich;
• możliwość prowadzenia hodowli komórkowej bezpośrednio na hydrofobowym podłożu;
• precyzyjne pozycjonowanie komórek, na wzorach elastyczności;
• precyzyjne pozycjonowanie komórek nowotworowych na wzorach o jednocześnie modyfikowanych właściwościach chemicznych i mechanicznych.

W pierwszym etapie realizacji projektu sprawdzano wpływ elastyczności jednorodnych podłoży polidimetylosiloksanu (PDMS), na proces adhezji i proliferacji dwóch linii komórkowych raka pęcherza moczowego – HCV29 z guza pierwotnego i metastatycznych komórek T24. Wykorzystano technikę naświetlania PDMS wzbogaconego komponentem światłoczułym, benzofenonem, do przygotowania podłoży elastomerowych o elastycznościach równych 0.75 MPa (‘miękki’ PDMS) i 2.92 MPa (‘twardy’ PDMS). Elastyczność wyznaczono za pomocą mikroskopu sił atomowych (AFM), pracującego w modzie spektroskopii sił. Podłoży tych użyto bezpośrednio do hodowli komórek.

Rysunek 1. Proliferacja komórek nowotworowych o różnym stopniu zaawansowania choroby nowotworowej na podłożach o różnej elastyczności.

 Hodowla komórek na hydrofobowym podłożu PDMS jest możliwa dzięki obecności w medium hodowlanym protein surowiczych, które po zaadsorbowaniu do podłoża PDMS służą jako macierz adhezji dla badanych komórek.

Rysunek 2. Stopień proliferacji komórek nowotworowych na podłożach PDMS o różnej elastyczności.

Obrazy fluorescencyjne zarejestrowane dla komórek nowotworowych hodowanych na podłożach PDMS o różnej elastyczności wykazały większą liczbę komórek na podłożach miękkich, dla obu badanych linii (Rys. 1). Jednakże stopień proliferacji, definiowany jako liczba komórek w kolejnych etapach hodowli, znormalizowana do ich ilości po 24 godzinach inkubacji na podłożu miękkim, jest znacząco wyższy dla komórek z guza pierwotnego (HCV29, Rys. 2a). Dodatkowo można zauważyć, że liczba komórek T24 po 24 godzinach inkubacji jest znacząco niższa dla twardszych podłoży (Rys. 2 b), co sugeruje, że właściwości mechaniczne podłoża w sposób istotny wpływają na ich adhezję.

Komórki są niezwykle czułe na zmianę warunków zewnętrznych. Dlatego, aby potwierdzić tezę, że proces preferencyjnej proliferacji komórek nowotworowych na podłożach miękkich jest związany wyłącznie z ich właściwościami mechanicznymi, przeprowadzono kompleksowe pomiary. Ich celem było sprawdzenie czy procedura przygotowania podłoży PDMS nie prowadzi do symultanicznej zmiany pozostałych właściwości fizykochemicznych. W tym celu przebadano szereg podłoży o elastyczności zmieniającej się monotonicznie od 1.67 do 0.24 MPa (Rys. 3a) za pomocą wielu metod eksperymentalnych, dających informację o składzie chemicznym (XPS, ToF-SIMS, FTIR), topografii (AFM), zwilżalności oraz energii powierzchniowej (pomiar kąta zwilżania, CA). Elastyczność podłoży mierzono za pomocą nanoindentera (Rys. 3a), który jest dedykowany do pomiarów właściwości mechanicznych jak również za pomocą mikroskopu AFM, pracującego w trybie spektroskopii sił. 

Rysunek 3. Zmiana elastyczności podłoża PDMS w funkcji czasu naświetlania (a) oraz związek między modułem Younga a parametrem elastyczności (b).

Druga z zastosowanych metod pozwala na wyznaczenie modułu Younga badanego materiału na podstawie analizy krzywych siła-odległość za pomocą standardowego modelu Herza. Jednakże dla podłoży PDMS, wykazujących silne oddziaływanie przyciągające próbnika, zastosowanie tego modelu nie jest możliwe. Dlatego w tym wypadku elastyczność podłoży charakteryzowano podając ‘parametr elastyczności’, zdefiniowany jako nachylenie krzywej siła-odległość i wyrażony w jednostkach N/m (wstawka w Rys. 3b). Wartość ta jest związana liniowo z modułem Younga (Rys. 3b).

Rysunek 4. Właściwości fizykochemiczne podłoży PDMS o różnej elastyczności – pomiar zwilżalności (CA, a), struktury chemicznej metodą ToF-SIMS (b) i XPS (c) oraz topografii (AFM, d)

Uzyskane wyniki składu chemicznego, topografii i zwilżalności w granicach niepewności pomiarowych pozostają niezmienne dla podłoży o różnej elastyczności (Rys. 4). Wskazuje to jednoznacznie, że proces ich przygotowania nie wpływa na pozostałe właściwości fizykochemiczne, a obserwowane zmiany zachowania komórek są indukowane wyłącznie zmianą jego elastyczności.  

Dla omawianych podłoży badano także efekt starzenia. Analiza XPS przeprowadzona po sześciu miesiącach od momentu przygotowania nie wykazała efektu starzenia, potwierdzając dużą stabilność podłoży PDMS, ważną z punktu widzenia potencjalnych zastosowań biomedycznych.

2 Podłoża z wzorem elastyczności

Uzyskane wyniki wykorzystano do precyzyjnego pozycjonowania komórek za pomocą ciągłych i dyskretnych wzorów elastyczności. Zagadnienie to jest niezwykle istotne, ponieważ w warunkach fizjologicznych komórki w sposób naturalny doświadczają ciągłych zmian właściwości mechanicznych otoczenia, jak na przykład na granicy kość – naczynie krwionośne. Precyzyjne pozycjonowanie komórek daje też możliwość sprawdzenia w jaki sposób komórki komunikują się i porządkują aby stworzyć tkankę, co jest kluczowym zagadnieniem transplantologii oraz może znaleźć szerokie zastosowanie w urządzeniach diagnostycznych. 

Rysunek 5. Mapy elastyczności (górny rząd) podłoży PDMS i obrazy fluorescencyjne zarejestrowane po 72h hodowli komórek HCV29 (dolny rząd) na miękkim (a), pośrednim (b) i twardym (c) podłożu PDMS.

Aby uzyskać przestrzenną kontrolę nad procesem adhezji i proliferacji komórek przygotowano podłoża z ciągłym i dyskretnym gradientem elastyczności, poprzez ich naświetlanie przez wydrukowaną maskę a następnie wykorzystano je do hodowli komórek nowotworowych pęcherza moczowego.

Uzyskane wyniki pokazują, że zastosowanie podłoża o ciągłym gradiencie elastyczności wymusza monotoniczną zmianę ilości obserwowanych komórek (Rys. 5). Na najdłużej naświetlanej, ‘miękkiej’ części podłoża proliferacja komórek HCV29 jest najbardziej efektywna (Rys. 5a). Wzrostowi sztywności podłoża towarzyszy monotoniczny spadek ilości obserwowanych komórek (Rys. 5b), najsilniejszy dla ‘twardego’ podłoża PDMS (Rys. 5c)

Z kolei zastosowanie podłoży z dyskretną zmianą elastyczności prowadzi do spontanicznego, dokładnego odwzorowania przez komórki granicy między ‘miękkim’ i ‘twardym’ obszarem PDMS (Rys. 6b)

Rysunek 6. Komórki HCV29 po 72h hodowli na podłożu miękkim (a), twardym (c) i na ich granicy (b)

W kolejnym kroku przygotowano podłoża z wzorem elastyczności, poprzez ich naświetlenie przez wydrukowaną maskę (Rys. 7a). Metoda ta jest niezwykle prosta i tania, pozwala także na tworzenie wzorów o dowolnych kształtach i rozmiarach, ograniczonych jedynie rozdzielczością drukarki użytej do drukowania matryc. Podłoża te wykorzystano do hodowli komórek, uzyskując wierne odtworzenie wzorów o różnych skalach. Daje to możliwość badania zarówno kolektywnych (Rys. 7b) jak i indywidualnych (Rys. 7c) reakcji komórek na zadany bodziec.

Rysunek 7. Wzory elastyczności podłoża PDMS (a) i ich odwzorowanie przez komórki HCV29 (b, c)

3 Podłoża o jednocześnie modyfikowanych właściwościach mechanicznych i chemicznych

Aby wzmocnić kontrast pomiędzy obszarami o różnej elastyczności, podjęto próbę dodatkowej modyfikacji podłoża PDMS, poprzez pokrycie go cienką warstwą polimerów wykazujących skrajnie różną cytokompatybilność – polistyrenu (PS) i poli(tlenku etylenu) (PEO). Zastosowanie takiej warstwy w sposób znaczący zmienia właściwości mechaniczne podłoża, dlatego w pierwszym etapie przeprowadzono systematyczne pomiary, których celem było określenie związku między grubością warstwy polimerowej, a efektywną elastycznością podłoża. Ponieważ nadrzędnym celem projektu była analiza wpływu właściwości fizykochemicznych podłoża na zachowanie komórek, które są wrażliwe na zmiany nie tylko na powierzchni, lecz także aż do kilku mikrometrów w głąb podłoża badano efektywną zmianę elastyczności układu PDMS + cienka warstwa polimerowa a nie samej warstwy polimerowej (Rys. 8).

Rysunek 8. Wpływ grubości warstwy polistyrenu (PS, a) i poli(tlenku etylenu) (PEO, b) na zmianę efektywnej elastyczności podłoża.

Dla obu badanych polimerów zaobserwowano podobny charakter zmian. Dla cienkich warstw (<100 nm) mierzona elastyczność jest porównywalna z wartością charakterystyczną dla podłoża PDMS, następnie obserwujemy jej gwałtowny wzrost aż do osiągnięcia stałej wartości dla warstw grubszych niż 200 nm, różnej dla obu polimerów. Tę różnicę wykorzystano do produkcji izotropowych wzorów elastyczności indukowanych separacją faz w mieszaninie PS/PEO (Rys. 9).

Rysunek 9 Wzory elastyczności indukowane procesem separacji faz w mieszaninie polimerów – mapy topografii (a), elastyczności (b) i adhezji próbnika (c).

Jak widać na rysunku 9, obszarom wysokim, zbudowanym z niewykazującego cytokompatybilności PS odpowiada także większa sztywność i niższy poziom adhezji, w odróżnieniu od niższych obszarów PEO, które wykazują większą elastyczność i zdolność adhezji. Udało się zatem stworzyć wzory, które mogą znaleźć zastosowanie do precyzyjnego pozycjonowania komórek. Efekt ten może być dodatkowo wzmocniony przez odpowiedni dobór polimerów oraz kształt i rozmiar wzoru, który może być kontrolowany poprzez warunki przygotowania warstwy.

Rysunek 10. Proliferacja komórek HCV29 na podłożu z izotropowym lub regularnym wzorem właściwości mechanicznych i chemicznych.

Naturalną kontynuacją przedstawionych badań była próba stworzenia wzorów komórek, dzięki jednoczesnej modyfikacji elastyczności podłoża i jego właściwości chemicznych. W tym celu jednorodne podłoże miękkiego PDMS pokryto izotropowymi lub regularnymi wzorami PS i wykorzystano je do hodowli komórek nowotworowych, które wiernie odtwarzały zadany wzór podłoża (Rys. 10), zajmując jedynie ‘miękkie’ obszary PDMS, o większej zdolności do adhezji komórek.

Prowadzone badania nad pokazały, iż elastyczność podłoża ma istotny wpływ na proces adhezji i proliferacji komórek nowotworowych, które są niezwykle wrażliwe na zmiany właściwości mechanicznych nawet w niewielkim zakresie. W odróżnieniu od doniesień literaturowych dla komórek prawidłowych, badane komórki rakowe wykazywały silną tendencję do preferencyjnej proliferacji na podłożach miękkich. Rezultat ten wykorzystano do precyzyjnego pozycjonowania komórek, które wiernie odtwarzają zarówno ciągłą, jak i dyskretną zmianę elastyczności podłoża. Efekt ten wzmocniono dodatkowo poprzez jednoczesną modyfikację właściwości mechanicznych i chemicznych podłoża, co pozwoliło na uzyskanie izotropowych i regularnych matryc, które mogą być odwzorowane przez komórki. Zaprojektowanie podłoży o odpowiednio dobranych właściwościach mechanicznych (elastyczność), chemicznych (rodzaj pokrycia polimerowego) oraz topograficznych (kształt i rozmiar wzoru) umożliwiło sterowanie procesem adhezji i proliferacji komórek. Poznanie tych procesów na poziomie komórkowym oraz dogłębna analiza mechanizmów oddziaływania komórki z podłożem i otoczeniem, a także wpływu zewnętrznych czynników, mogących determinować proces adhezji i proliferacji, jest zagadnieniem kluczowym w wielu dziedzinach biofizyki i medycyny. Podłoża, na których dzięki odpowiednio dobranym właściwościom uda się wzmocnić lub zahamować proces adhezji i proliferacji wybranego typu komórek mogą stanowić  podstawę nowej, obiecującej metody diagnostycznej, pozwalającej na identyfikację komórek nowotworowych dla preparatów nie wyizolowanych z otaczającej tkanki.